简介

空间转录组技术作为解析基因表达空间分布的核心工具，其实验流程的规范性直接影响数据质量与研究结论。本文从技术支持角度，系统梳理实验各环节的关键参数、常见问题及解决方案，为科研人员提供实操性指导。

技术方法和分类

空间转录组技术主要分为基于测序和基于成像两大类：

（一）基于测序的方法

1. 工作流程：组织切片贴合带空间条形码的芯片，透化后释放的mRNA与芯片上带位置标签的引物结合，经原位逆转录使cDNA带上位置信息，测序后结合形态学得到基因空间表达图谱。

2. 技术举例

·10x Genomics Visium：芯片含 4 个捕获区，每个区有5000个55 μm 直径的spots，适用于多种组织的大面积分析。

·Slide-seq：用10 μm带DNA标签引物的微球，分辨率高，利于单细胞转录组空间定位。

·Stereo-seq：基于DNB芯片，实现高分辨率与厘米级大视野分析，适合大尺寸样本。

（二）基于成像的方法

1. 工作流程：特异性探针与mRNA杂交，经荧光标记后原位成像，依据信号位置和强度确定mRNA空间分布，需通过ISH或ISS区分mRNA种类。

2. 技术举例

·MERFISH：多轮FISH结合独特编码，亚细胞分辨率下对大量基因成像，解析细微表达差异。

·seqFISH：序列化探针编码与杂交轮回，可检测上千基因，亚细胞分辨率，全转录组成像效果佳。

实验设计要点

（一）样本选择与处理

样本类型：新鲜冷冻组织为理想样本，FFPE样本可使用但需特殊处理以提高RNA质量。

样本制备：新鲜组织需快速冷冻，FFPE样本需脱蜡、抗原修复；切片厚度5-10 μm，平衡mRNA捕获量与空间分辨率。

（二）技术选择

基于实验目的：整体空间分布分析且需大视野、高通量数据，选基于测序的技术（如10× Visium）；亚细胞水平研究特定基因，选基于成像的技术（如MERFISH）。

基于样本特点：样本量少选对起始量要求低的技术；复杂组织（如大脑、肿瘤）需高分辨率技术，简单组织可选低分辨率技术。

（三）对照设置

实验对照：阴性对照检测背景信号，阳性对照验证流程准确性。

生物学重复：每组至少3-5个，确保结果可重复与有统计学意义。

数据分析流程

（一）数据预处理

1. 基于测序数据

·读取fastq格式数据，质控后过滤低质量reads。

·识别并校正空间条形码，确保基因表达数据与位置正确关联。

·比对reads到参考基因组，用STAR等软件定量基因表达（以FPKM或TPM表示）。

2. 基于成像数据

·采集图像，大面积样本需拼接以保证对齐。

·增强图像对比度、扣除背景噪声，提高信号准确性。

·识别信号点并定量，荧光信号需转换为mRNA拷贝数或相对表达量。

（二）数据标准化

1. 全局标准化：调整样本基因表达总量至同一水平，便于样本间比较。

2. 分位数标准化：使样本相同分位数位置的表达值相等，校正分布差异。

3. 基于内参基因：用表达稳定的内参基因校正样本间技术差异，需验证内参适用性。

（三）空间特征识别与分析

1. 聚类分析：结合基因表达与空间位置，用层次聚类等算法聚合同类细胞或区域，体现空间连续性。

2. 差异表达分析：用DESeq2等方法比较不同组的空间基因表达差异，筛选显著差异基因。

3. 基因集富集分析：将差异基因映射到GO、KEGG等基因集，揭示涉及的生物学功能与通路。

4. 空间自相关分析：通过Moran's I等系数，评估基因表达的空间聚集或分散趋势。

（四）细胞类型注释与空间定位

1. 结合scRNA-seq数据：利用scRNA-seq的细胞类型特征基因，通过相关性或分类模型注释空间转录组中的细胞类型。

2. 空间细胞分割与定位：高分辨率数据需分割细胞，用分水岭算法等确定细胞位置，精确研究细胞互作与表达异质性。

（五）数据可视化

1. 热图：展示基因在不同空间位置或样本组的表达差异，直观反映表达高低。

2. 气泡图：以气泡大小和位置表示基因表达量与空间坐标，同步展示表达与分布。

3. 空间点图：将表达量以点绘在组织切片上，结合形态学理解表达与解剖结构关系。

4. 三维可视化：整合基因表达与组织三维结构，立体呈现基因分布，适用于三维数据或多维度信息展示。

参考文献

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