抗体研发平台-北京百欧泰生物科技有限公司

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抗体亲和力测定

服务简介

抗体亲和力是指抗体与抗原表位或其决定簇之间的结合力，这种作用力包括氢键、引力、疏水作用力等。亲和力大小可以用K_D表示，计算方法为：

K_D=[Ab-H]/([Ab][H])

式中[]代表摩尔浓度，Ab为抗体，H为半抗原，Ab-H为结合物。

服务内容

百欧泰生物技术团队运用平台的技术系统对抗体的亲和力和动力学进行测量，基于光学效应的技术－表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)和生物膜层表面干涉技术（bio－layer　interferometry, BLI），可以检测分子间相互作用并进行实时监测。

测定方法

1. 酶联免疫吸附法（ELISA法）

ELISA法灵敏度高，检测的数量级可以达到10-8，也是抗体亲和力测定常用的方法。ELISA测定方法：抗体与定量的抗原在溶液中温育进行反应，反应平衡后，将溶液转移到含有固相抗原的聚苯乙烯微板内，用间接ELISA法测定游离抗体量。根据OD值计算亲和力常数K_D。当抗原量大于10倍抗体量时，可以忽略抗体含量。计算方法如下所示，其中A0为抗体的OD值，A1为加入质量摩尔浓度为a的抗原后的OD值，K_d为K_D的倒数。

1+K_d/a=A₀/(A₀-A₁)

2. 生物膜干涉技术（BLI）

实验原理：利用Fortebio Octet仪器测定抗体亲和力。生物传感器底端覆盖有相互作用的分子生物膜，当传感器上的分子生物膜与溶液中的分子发生作用时，生物层的厚度就会增加。将具有一定带宽的可见光垂直射向生物膜，光在生物膜两层界面中反射被光谱仪检测到干涉波，生物膜厚度改变，导致干涉光谱曲线发生移动，通过相位移动定量分析生物膜表面分子数量和浓度变化。

抗体亲和力测定.png

3. 固相放射免疫法（SP-RIA）

SP-RIA法在测定抗体亲和力常数方面较为准确。测定方法：用抗原包被微板，加入定量单克隆抗体，温育，达到平衡后，洗去未结合的单克隆抗体，加放射性同位素标记的抗小鼠lg二抗，温育后洗涤，割下小孔后计数结合的放射性强度。这个方法前提是保持包被的抗原量不变。具体计算方法如下，式中[Ab]a为结合抗体浓度，[Ab]r为总抗体浓度，n为抗体结合价。

([Ab]_a /[Ab]_r-[Ab]_b)/[Ab]_a=-nK

4. 平衡透析法

平衡透析法测定抗体亲和力要求配体必须是可以穿过半透膜的小分子且必须进行标记（如果抗原为大分子，则要求抗体片段能够穿过半透膜）。标记后的配体缓冲液置于半透膜一侧，特异性抗体置于另一侧，随着时间推移配体会穿过半透膜进入另一侧，与特异性抗体结合，两边的配体浓度会渐渐达到平衡。反应平衡时，计算出亲和力常数。公式中[Ab]为抗体结合位点的浓度，由抗体质量摩尔浓度×抗体结合价计算而来；[H]为游离配体的质量摩尔浓度，[b]为结合配体的质量摩尔浓度。

1/[b]=1/(k[H][Ab])+1/[Ab]

5. 结合抗原沉淀法

这种方法的实验原理是将单价抗原与抗体温育进行反应，平衡后，用50%饱和硫氨酸或15%聚乙二醇进行沉淀，从而将游离抗原与结合体分离，分别测定浓度并计算出K_D。

6. 放射免疫法（RIA）

放射免疫法是将足够过量的单克隆抗体与痕量的放射性标记抗原进行温育，反应平衡后测定结合曲线，50%峰值结合处单克隆抗体结合价浓度的倒数就是K_D。

实验服务流程

双方沟通一致后确定实验方案，确定服务要求-签订合同—预付款-开始实验-成果交付